亞細胞定位常見問題 細胞是構成生物體的基本結構單位和功能單位，是生命的物質基礎。細胞的結構復雜精巧且高度有序，根據功能和空間分布的不同，細胞內部可以進一步劃分為不同的細胞區域或細胞器，即亞細胞，其結構只能通過電子顯微鏡才能觀察。常見亞細胞有細胞核、細胞膜、內質網、高爾基體、細胞質、線粒體、葉綠體等。每種亞細胞中都存在一組特定的蛋白質，亞細胞結構為這些蛋白質行使功能提供了相對獨立的生命活動場所。蛋白質在細胞質中經過翻譯并合成，由蛋白質分選信號引導而被轉運到特定的亞細胞中以參與細胞的各種生命活動，這一過程就稱為蛋白質的亞細胞定位。

原理簡介

GFP、RFP等熒光蛋白因其獨特的熒光性質和靈敏性，常作為報告基因研究并分析基因產物在細胞中的定位和相互作用等。將目標蛋白與熒光蛋白的N端或者C端融合，通過瞬時轉化技術或穩定遺傳轉化技術，使得該融合蛋白在受體材料細胞內表達，目標蛋白會牽引熒光蛋白一起定位到目標細胞器，通過顯微鏡觀察熒光蛋白在細胞內顯示的位置，確定目標蛋白的位置，從而確定目標蛋白的亞細胞定位情況。

常見問題答疑

1、構建亞細胞定位載體時，GFP融合位置為什么有N端、C端之分？

若序列中存在信號肽，則構建載體時需避開這一端來融合熒光蛋白。需注意不同的融合方式可能會得到不同的定位結果，例如融合在熒光蛋白N端的目標蛋白一般無法得到過氧化物酶體的定位結果；融合在熒光蛋白C端的目標蛋白一般無法得到線粒體、質體的定位結果。

2、為什么不同的受體材料有時得到的定位結果不一樣？

不同物種的細胞在翻譯表達基因時，其表達模式和影響因子不同。受物種差異的影響，同一個載體在不同的受體材料中表達的位置可能不同，因此建議實驗時盡可能選用與目的基因來源相近的受體材料進行表達。

3、用水稻原生質體進行亞細胞定位時，為什么不拍攝葉綠體的自發熒光？

經測驗，使用水稻黃化苗制備原生質體，載體轉化效率及基因表達強度較高，而黃化苗中葉綠體較少，因此水稻原生質體定位拍照時，除非與葉綠體共定位，否則不拍攝葉綠體的自發熒光。

4、為什么要提供GFP空載的對照圖片？

（1）作為整個實驗過程中的操作參照，可排除因實驗操作而導致目的基因沒有熒光信號的影響。

（2）作為載體體系的參照，確認構建載體時所使用的載體是可正常表達熒光蛋白的。

5、為什么有的共定位圖片中葉綠體通道是玫紅色？

在擬南芥、煙草、玉米、大麥、小麥等材料中，種植培養苗子時是正常接受光照的，葉片中含有大量葉綠體，而葉綠素在640nm左右的激發光下可產生紅色的自發熒光。當在這些含葉綠體較多的受體材料中做共定位實驗時，共定位marker一般為紅色熒光（在560nm左右的激發光下），實驗及共聚焦拍攝時兩個波長通道的熒光互不影響，但視野下看著比較混淆，尤其疊加后二者不易分清，因此只是在顏色顯示上將葉綠體自發熒光設置為玫紅色，以顯示和共定位marker的區別。

6、為什么有的基因定位結果與預想的不一致？

對于一個特定的定位載體，只要熒光表達較好，其定位結果是確定的，不會隨人為意愿或操作而改變。至于有時候和預想的結果不一樣，可能和蛋白本身、選擇的表達載體以及熒光蛋白融合方式等有關。

7、為什么有的普通定位結果出來后無法準確判斷其定位位置？

細胞中的細胞器復雜且多樣，除一些常見的、特征比較明顯的細胞器外，有些細胞器在激光共聚焦下形狀比較相似，例如：線粒體、過氧化物酶體、高爾基體等細胞器，它們的熒光表達形狀可能都是點狀，因此不易區分。這時可以結合基因的其他功能研究來判斷其可能表達的位置。另外，蛋白表達本身也是一個復雜的過程，涉及到多個合成場所及轉運過程，自身表達情況可能比較復雜，因此不易判斷具體的表達位置。

8、為什么不先對一個基因做預測，在預測的結果上直接做共定位？

不同的預測網站有不同的計算方法，同一個基因在不同的預測網站也可能得出不同的定位結果。另外所有的結果都應是基于實驗得到的，對于不清楚可能定位在哪里的基因，一般推薦先做普通定位，根據普通定位的結果再決定做哪種細胞器的共定位。

9、為什么有的基因做原生質體轉化時熒光蛋白不亮？

不同物種的細胞可能對基因表達有影響，當在一種材料的原生質體中觀察不到熒光時，可以考慮換一種受體材料。另外，如果是分泌蛋白，在原生質體中無法觀察到熒光，此時可以考慮注射煙草葉片來觀察熒光。

10、拍攝時為什么有明場通道？

（1）顯示細胞狀態，有活力的原生質體細胞應該是飽滿圓潤的，變形或破碎的細胞說明此時細胞不是適狀態或細胞已死亡。

（2）顯示熒光確實是細胞內蛋白表達的，而不是細胞碎片及雜質產生的雜光。